Une carte du tronc cérébral pour les sensations viscérales

Nature volume 609, pages 320–326 (2022)Citer cet article

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Une correction de l'éditeur à cet article a été publiée le 14 octobre 2022

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Le système nerveux utilise diverses stratégies de codage pour traiter les entrées sensorielles. Par exemple, le système olfactif utilise de vastes répertoires de récepteurs et est câblé pour reconnaître diverses odeurs, tandis que le système visuel fournit une grande acuité de la position, de la forme et du mouvement de l'objet1,2,3,4,5. Par rapport aux systèmes sensoriels externes, les principes qui sous-tendent le traitement sensoriel par le système nerveux intéroceptif restent mal définis. Ici, nous avons développé une préparation d'imagerie calcique à deux photons pour comprendre les représentations des organes internes dans le noyau du tractus solitaire (NTS), une passerelle sensorielle dans le tronc cérébral qui reçoit les entrées vagales et autres du corps. En nous concentrant sur les stimuli de l'intestin et des voies respiratoires supérieures, nous avons observé que les neurones NTS individuels sont réglés pour détecter les signaux d'organes particuliers et sont topographiquement organisés en fonction de la position du corps. De plus, certaines entrées mécanosensorielles et chimiosensorielles du même organe convergent de manière centrale. Les entrées sensorielles engagent des domaines NTS spécifiques avec des emplacements définis, chacun contenant des types de cellules hétérogènes. Les représentations spatiales de différents organes sont encore affinées dans le NTS au-delà de ce qui est réalisé par le tri axonal vagal seul, car le blocage de l'inhibition du tronc cérébral élargit le réglage neuronal et désorganise les représentations viscérales. Ces résultats révèlent des caractéristiques organisationnelles de base utilisées par le cerveau pour traiter les entrées intéroceptives.

Les circuits sensoriels transforment les entrées physiques de base - photons de lumière, ondes sonores, produits chimiques et forces mécaniques - en représentations et perceptions complexes des stimuli. Des découvertes marquantes ont fourni des informations sur la manière dont les circuits neuronaux réalisent ces transformations pour nos systèmes sensoriels externes. Les exemples incluent la carte guidée par les récepteurs olfactifs dans le bulbe olfactif1,2, l'homoncule cortical dans le système somatosensoriel6 et les cartes du système visuel qui extraient des caractéristiques de stimulus de plus en plus complexes à mesure que l'information monte3,4,5. En revanche, on comprend moins comment les signaux intéroceptifs sont traités.

Le cerveau reçoit des informations sensorielles vitales des organes internes du corps et utilise ces informations pour orchestrer des fonctions autonomes cruciales telles que la respiration, la fréquence cardiaque, la pression artérielle et la motilité intestinale, pour assurer l'intégrité des voies respiratoires et pour moduler les comportements d'alimentation, de boisson et de nausées7,8, 9,10,11,12,13,14,15. Les principaux signaux respiratoires, cardiovasculaires et digestifs sont principalement transmis au cerveau par le nerf vague, qui contient des dizaines de types de neurones sensoriels spatialement entremêlés dans les ganglions sensoriels11,12,14,15,16. Par exemple, les neurones sensoriels de l'intestin détectent les produits chimiques et s'étirent pour informer sur la qualité et la quantité des aliments ingérés, fournissent des signaux de récompense nutritionnelle, orchestrent le métabolisme systémique et contribuent à la sensation de satiété après un repas9,10,13,15,17 . Les neurones sensoriels vagaux innervant le larynx détectent des signaux chimiques et mécaniques similaires et initient des réflexes protecteurs qui protègent les voies respiratoires contre l'aspiration12,18. Des stimuli identiques appliqués au larynx ou au tractus gastro-intestinal induisent des réponses physiologiques et comportementales distinctes. Cela suggère que l'emplacement d'un stimulus dans le corps est une caractéristique clé qui doit être décodée par les circuits neuronaux en aval.

Les axones sensoriels vagaux traversent le crâne et ciblent principalement le NTS, un grand centre sensoriel dans le tronc cérébral pour les informations intéroceptives et gustatives19,20. Les axones centraux des afférences vagales et autres afférences crâniennes affichent une certaine topographie dans leurs projections NTS, telles que visualisées par des techniques génétiques ou une injection de colorant ciblée sur les tissus7,8,9,14,15,21,22. Par exemple, les informations gustatives sont traitées de manière rostrale, tandis que les informations intéroceptives sont traitées de manière caudale19. Cependant, le traçage des voies d'axones vagales ne révèle pas les propriétés de réponse et les transformations d'entrée qui peuvent se produire dans les neurones NTS, qui ont des tonnelles dendritiques élaborées et peuvent potentiellement contacter des axones sensoriels à distance20,23,24. D'autres approches classiques telles que l'électrophysiologie in vivo et l'immunohistochimie cFos ont fourni des informations importantes sur les réponses NTS20,23,24,25,26,27. Cependant, en raison de limitations techniques, ces études ont produit des conclusions contradictoires sur l'organisation des neurones NTS qui répondent à différents signaux intéroceptifs20,24,28. Ici, nous nous concentrons sur les entrées sensorielles classiques et bien définies du tractus gastro-intestinal et des voies respiratoires supérieures pour révéler les caractéristiques de base du codage sensoriel viscéral.

Nous avons développé une préparation d'imagerie calcique à deux photons in vivo chez la souris pour permettre une analyse massivement parallèle, spatialement résolue et en temps réel des réponses des neurones NTS individuels à plusieurs stimuli d'organes internes. Nous avons utilisé un indicateur de calcium localisé dans le noyau et décalé vers le rouge (jRGECO1a fusionné avec l'histone H2B)29,30, administré par un virus adéno-associé (AAV) avec un promoteur qui pilote l'expression constitutive dans les neurones. Les indicateurs de calcium localisés au niveau nucléaire sont largement utilisés, suppriment le signal de fond du neuropile et affichent des amplitudes et une cinétique de réponse compatibles avec la mesure des réponses intéroceptives29,30 (données étendues Fig. 1a – f). Les artefacts de mouvement cérébral ont empêché l'imagerie chez une souris éveillée, mais étaient négligeables sous anesthésie après l'implantation d'une fenêtre crânienne (Vidéo supplémentaire 1). La surface dorsale du tronc cérébral a été exposée après l'ablation chirurgicale d'une partie du cervelet, et une microscopie à deux photons a été réalisée sur une grande zone et profondeur caudale du NTS (509 × 509 × 320 μm). Cette plateforme a permis l'enregistrement simultané d'environ 2 800 neurones et la cartographie tridimensionnelle des représentations d'organes (Vidéo supplémentaire 2).

Nous avons d'abord validé l'imagerie calcique NTS en observant les réponses à la distension gastrique (Fig. 1a – d), un stimulus intéroceptif classique qui active les neurones NTS8,13. La distension mécanique de l'estomac glandulaire à travers un ballonnet implanté chirurgicalement induit des transitoires calciques dans les neurones NTS. Les réponses étaient hautement reproductibles et se sont produites à des niveaux physiologiques comparables au volume d'un repas de souris (environ 300 μl) (Fig. 1d et données étendues Fig. 2a, b). Les réponses étaient dose-dépendantes (Fig. 1d) et l'amélioration de la distension gastrique augmentait à la fois le nombre de neurones répondants et l'intensité de la réponse dans les neurones individuels. Le regroupement des K-moyennes a révélé deux types de réponse pouvant être attribués à une adaptation rapide ou lente, et la cinétique de réponse pour les neurones individuels était cohérente d'un essai à l'autre (Fig. 1c et Extended Data Fig. 2). Toutes les réponses de distension gastrique observées dans le NTS caudal ont été abolies après vagotomie sous-diaphragmatique bilatérale (Fig. 1d), ce qui indique que les réponses observées sont transmises par les neurones sensoriels vagaux.

a, dessins animés illustrant l'imagerie calcique à deux photons NTS (à gauche) et la distension du ballon gastrique (à droite). b, images NTS à deux photons représentatives de la fluorescence H2B-jRGECO1a au départ et pendant l'étirement de l'estomac, plan transversal. Les pointes de flèches vertes indiquent les neurones réactifs. M, médial ; R, rostral. c, Heatmaps illustrant toutes les réponses neuronales NTS observées (pic ΔF/F normalisé) à un étirement de l'estomac de 40 s (600 μl). k-means clustering a défini des neurones à adaptation lente (en haut : 548) ou des neurones à adaptation rapide (en bas : 696) de 19 souris. d, Heatmap illustrant les réponses NTS (188 neurones, 2 souris) à la distension gastrique (150, 300, 600 et 900 μl) avant et après vagotomie sous-diaphragmatique. e, Heatmap illustrant toutes les réponses observées des neurones NTS (1 133 neurones, 6 souris) à une série de stimuli de distension orale du ballon (200 μl), de perfusion d'eau laryngée, de distension de l'estomac (150, 300, 600 et 900 μl), de distension du duodénum (90 , 115 et 140 μl), distension du jéjunum (90, 115 et 140 μl) et distension du caecum (100, 250 et 350 μl). f, Matrice de coefficients de corrélation de ΔF/F maximal pour chaque paire de stimulus sur tous les neurones sensibles à tout stimulus dans e. g, Heatmap représentant toutes les réponses neuronales NTS observées (484 neurones, 4 souris) à une perfusion laryngée successive de sel élevé (10 × PBS), d'eau ou d'acide citrique (25 mM, pH 2, 6). Les réponses correspondent à la moyenne de deux essais. h, Coefficients de corrélation (R) de ΔF/F maximal pour chaque paire de stimuli sur tous les neurones réactifs en g (gauche, boîte 6 × 6) ou pour les paires de stimuli de e qui comprenaient l'eau laryngée et le stimulus d'étirement le plus élevé dans chaque organe sur tous neurones sensibles à ces stimuli (droite, colonne 1 × 6). Barre d'échelle, 100 μm (b). Barres blanches, 10 s (c–e,g).

Données source.

Ensuite, nous avons étudié les propriétés de réglage des neurones NTS individuels en examinant les réponses à plusieurs stimuli intéroceptifs. Le NTS viscéral reçoit divers stimuli mécaniques, chimiques, osmotiques et thermiques provenant de nombreux endroits du corps. Par conséquent, nous avons initialement varié l'emplacement du stimulus tout en gardant la modalité du stimulus constante lorsque cela était possible. La position, le moment et l'ampleur des stimuli mécanosensoriels peuvent être contrôlés avec précision et appliqués de manière répétée. Par conséquent, nous avons activé des neurones mécanosensoriels dans la cavité buccale, l'estomac, le duodénum, ​​le jéjunum et le caecum chez la même souris par distension tissulaire localisée. La distension du larynx n'a pas été obtenue en raison de sa petite taille chez la souris, de sorte que les neurones laryngés ont plutôt été activés par la perfusion d'eau, une modalité sensorielle distincte qui a été bien caractérisée pour activer les afférences vagales12,18,27. Des réponses ont été observées pour chaque stimulus dans le NTS caudal, avec plus de neurones détectant la distension de l'estomac, la distension du duodénum ou l'eau laryngée (environ 62 %, 20 % et 4 % de tous les neurones répondants, respectivement). Moins de neurones ont répondu à la distension de la cavité buccale, du jéjunum ou du caecum (environ 1 % chacun ; Fig. 1e et Extended Data Figs. 3a–e et 4). Notamment, la majorité des neurones réactifs (89,8%, 1 018 neurones sur 1 133, 6 souris) ont été sélectivement stimulés par des signaux émanant d'un organe spécifique (Fig. 1e et Extended Data Fig. 3a – e). Les neurones qui ont répondu à deux entrées d'organes ou plus ont été observés de manière fiable dans les expériences, mais étaient rares et étaient les neurones à double réglage les plus courants répondant à la fois à la distension de l'estomac et du duodénum (données étendues Fig. 3d). De plus, même les neurones qui ont montré des réponses significatives à deux ou plusieurs entrées d'organes ont généralement répondu plus fortement à l'un d'eux (Extended Data Fig. 3f, g). Les réponses neuronales aux stimuli d'intensité différente dans le même organe étaient plus corrélées (R = 0, 60) que les réponses aux stimuli dans différents organes (R = 0, 10) (Fig. 1f).

Des études de transcriptomique unicellulaire ont révélé que le NTS contient divers types de cellules, y compris plusieurs classes de neurones excitateurs et inhibiteurs31. Les neurones inhibiteurs dans d'autres systèmes sensoriels sont souvent largement accordés32,33. Par conséquent, pour distinguer les contributions des neurones inhibiteurs et excitateurs du NTS, les transitoires de calcium ont été mesurés chez des souris Slc32a1-ires-cre (également appelées Vgat-ires-cre) qui contiennent également un allèle Gfp dépendant de Cre. Les neurones inhibiteurs ont été engagés par chaque stimulus d'organe interne testé et ont affiché des propriétés de réglage nettement similaires aux neurones GFP-négatifs ou à la population globale de NTS (Extended Data Fig. 5). Ainsi, les entrées sensorielles de différents organes activent des ensembles largement discrets de neurones NTS excitateurs et inhibiteurs.

Nous avons également obtenu la collection suivante de neuf souris Cre qui marquent différentes sous-populations de neurones NTS et/ou de types de neurones qui ont été précédemment liés à des fonctions physiologiques particulières : (1) Th-cre, (2) Cartpt-ires-cre, (3 ) Calcr-ires-cre, (4) Pdyn-ires-cre, (5) Tac1-ires-cre, (6) Penk-ires-cre, (7) Gcg-cre, (8) Sst-ires-cre et (9) Crhr2-ires-cre. L'étirement de l'estomac et l'étirement de l'intestin ont activé les neurones NTS marqués dans chaque lignée Cre (Extended Data Fig. 6), bien que des différences quantitatives aient été notées dans quelques cas. En particulier, les neurones marqués chez les souris Crhr2-ires-cre ont été enrichis médialement et ont répondu plus fréquemment à l'étirement du duodénum. En revanche, les neurones marqués chez les souris Th-cre étaient enrichis plus latéralement et répondaient moins fréquemment à l'étirement du duodénum. Pris ensemble, ces résultats montrent que différentes entrées viscérales peuvent engager un assortiment hétérogène de types de cellules, et chacun de ces types de cellules définis par Cre est recruté à travers différentes représentations sensorielles.

Ensuite, nous avons demandé comment le NTS représente différentes modalités sensorielles du même organe. Nous nous sommes concentrés sur le larynx, ce qui a permis des comparaisons avec de précédentes études électrophysiologiques in vivo18,27, et sur l'intestin. Les neurones sensoriels vagaux innervant le larynx détectent divers défis chimiques, y compris l'eau, le sel et l'acide, et déclenchent des réflexes protecteurs qui protègent les voies respiratoires contre l'aspiration12. Au cours d'une séance d'imagerie NTS, une canule a été implantée sous les cordes vocales et une solution saline a été perfusée à travers le larynx à un débit lent (500 μl min–1), ce qui n'a pas déclenché de réponses mécaniques de fond. Des réponses de neurones NTS robustes et reproductibles ont été observées lorsque la solution de stimulation a été remplacée par de l'eau, une teneur élevée en sel (PBS 10 ×) ou de l'acide citrique (25 mM, pH 2, 6) sans modifier le débit. Bien que de rares neurones NTS aient affiché des réponses sélectives à des stimuli laryngés spécifiques (données étendues Fig. 3h), la majorité ont été engagées par tous les stimuli testés (Fig. 1g, h et données étendues Fig. 3h, i). Les réponses neuronales étaient mieux corrélées entre les applications répétées de stimuli laryngés identiques (R = 0,62) ou différents (R = 0,47) qu'entre l'eau laryngée et les stimuli d'autres organes (R = 0,07). Les neurones NTS sont plus largement accordés aux stimuli laryngés que les neurones sensoriels vagaux12,18, ce qui indique une convergence des informations sensorielles lorsque les signaux montent dans le cerveau. L'intégration des signaux laryngés peut fournir une explication basée sur les circuits pour expliquer comment différentes menaces des voies respiratoires peuvent induire un programme moteur commun de défense des voies respiratoires.

Ensuite, nous avons comparé les représentations NTS de l'étirement intestinal et des nutriments intestinaux, deux stimuli qui induisent la sensation de satiété9,10,13,15,17,34. L'application aiguë de glucose dans le duodénum proximal (300 mM dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS), 100 μl, orifice de sortie à 1, 5 cm distalement) a activé de manière cohérente les neurones NTS chez les animaux (données étendues Fig. 4c). En revanche, le HBSS seul ne l'a pas fait, ce qui suggère que ce petit bolus était insuffisant pour déclencher les neurones mécanosensoriels. Nous notons que le glucose intestinal peut activer à la fois une voie de réponse dédiée et d'autres neurones non mécanosensoriels qui sont plus largement accordés, par exemple, aux stimuli osmotiques8,10,34. Dans le NTS, nous avons observé une certaine convergence des réponses au glucose intestinal et à l'étirement intestinal ; 42, 2% des neurones NTS sensibles au glucose ont également été activés par la distension du duodénum et 31, 0% des neurones sensibles à la distension du duodénum ont également été activés par le glucose (données étendues Fig. 4d). Nous avons également noté qu'un plus petit groupe de neurones NTS sensibles au glucose a détecté une distension de l'estomac. Cependant, les neurones sensibles au glucose étaient 6,8 fois plus susceptibles de répondre à l'étirement duodénal qu'à l'étirement de l'estomac par rapport aux neurones NTS en général. Ce résultat indique que la convergence du signal n'est pas aléatoire, mais affiche plutôt une certaine sélectivité d'organe. Les signaux mécaniques et chimiques dans le duodénum activent différents neurones sensoriels vagaux mais chevauchent les neurones NTS8,14,34, ce qui indique une convergence de haut niveau qui se produit dans le tronc cérébral. Une telle convergence partielle du signal peut refléter une conception économique dans laquelle les neurones polymodaux médient les effets physiologiques et comportementaux communs induits par les deux stimuli, tandis que les neurones NTS plus sélectifs préservent la discrimination des modalités. Ensemble, nos données indiquent que le NTS contient des populations neuronales largement discrètes qui codent des stimuli provenant d'organes distincts et, dans certains cas, des ensembles au moins partiellement superposés qui sont engagés par plusieurs stimuli provenant des mêmes organes.

En plus de révéler les propriétés de réglage neuronal, l'imagerie calcique in vivo fournit des informations spatiales précises pour des milliers de neurones répondants dans une grande région NTS en une seule expérience. Dans les ganglions sensoriels vagaux, les neurones qui détectent les entrées de différents organes sont mélangés à la manière du sel et du poivre8,14. En revanche, nous avons observé ici un ordre spatial remarquable qui se produit dans le NTS, avec des neurones proches affichant des propriétés de réponse similaires. Les neurones sensibles à l'étirement de l'estomac étaient regroupés dans une région NTS bordée latéralement par les noyaux de la colonne dorsale, qui répondaient aux stimuli cutanés qui n'activaient pas le NTS (Extended Data Fig. 7a), et le long de l'axe antérieur-postérieur étaient les plus répandus près de la limite antérieure de l'area postrema (Fig. 2a).

a, Images NTS représentatives à deux photons de la fluorescence H2B-jRGECO1a (vue transversale, les images sont orientées de la même manière), avec des neurones codés par couleur en fonction des réponses maximales à l'eau laryngée (100 μl), de l'étirement de l'estomac (150, 300, 600 et 900 μl) ou étirement duodénal (90, 115 et 140 μl). DCN, noyaux de la colonne dorsale ; AP, zone postréma. Barre d'échelle, 100 μm (a). b, les positions des neurones sont cartographiées par type de réponse. Origine de l'axe : centre de gravité des neurones sensibles à l'étirement de l'estomac. Le nombre suivant de neurones et de souris a été analysé : oral-estomac : 1 204 neurones, 11 souris ; larynx–estomac : 10 610 neurones, 57 souris ; duodénum–estomac : 28 556 neurones, 107 souris ; jéjunum–estomac : 13 050 neurones, 66 souris ; caecum–estomac : 415 neurones, 9 souris. L'échelle de couleurs représente la densité des neurones (méthodes). Longueur d'axe, 150 μm. M, médial ; R, rostral. c, Schéma illustrant l'emplacement relatif des différents domaines de réponse des organes dans le NTS. d, les positions des neurones sont cartographiées par type de réponse. Origine de l'axe : centre de gravité des neurones sensibles au glucose duodénal (300 mM, HBSS). n = 425 neurones (à gauche) ou 97 neurones (à droite), 2 souris. e, Quantification de la ségrégation des neurones en réponse au glucose du duodénum des neurones sensibles à l'étirement du duodénum ou de l'estomac. Moyenne ± sem, ** P < 0,0001, test Mann-Whitney bilatéral. Voir Méthodes de calcul de l'indice de ségrégation. f, dessin animé illustrant les sites de distension du ballonnet dans le tractus gastro-intestinal. g, les positions des neurones sont cartographiées par type de réponse et origine de l'axe : centroïde des neurones sensibles à l'étirement du duodénum. Le nombre suivant de neurones et de souris a été analysé : à gauche : 14 981 neurones, 71 souris ; milieu : 2 846 neurones, 53 souris ; à droite : 280 neurones, 7 souris. Longueur d'axe, 150 μm. h, Quantification de la ségrégation des neurones en g sensibles à l'étirement du duodénum des neurones sensibles à d'autres stimuli. Moyenne ± sem, **** P < 0,0001, test de comparaisons multiples de Dunn suivant le test de signification de Kruskal-Wallis.

Données source.

Les positions des neurones NTS sensibles à l'étirement de l'estomac ont fourni un repère anatomique pour comparer les emplacements des neurones sensibles à d'autres stimuli. Les neurones sensibles à l'étirement du duodénum étaient situés plus médialement près de la frontière du NTS et de l'area postrema (Fig. 2a). L'analyse de la distribution spatiale de tous les neurones qui répondaient sélectivement à l'étirement de l'estomac et du duodénum a révélé une ségrégation centroïde d'environ 60 μm par plan de vue, et la ségrégation est devenue plus prononcée dans les régions NTS plus profondes et plus ventrales (Extended Data Fig. 7c – e ). Les positions relatives des neurones sensibles à l'étirement de l'estomac et du duodénum étaient stéréotypées, facilement localisées chez les animaux et conservées à travers les anesthésiques (Fig. 2a et Données étendues Fig. 1g – i). Comme on l'observe couramment dans d'autres cartes cérébrales35, nous avons observé un ordre à méso-échelle et une certaine hétérogénéité à l'échelle microscopique lorsque les neurones récepteurs de l'estomac et de l'intestin étaient entremêlés à la frontière entre les domaines. Une analyse similaire a révélé que les neurones activés par les stimuli de la cavité buccale, du larynx, du jéjunum et du caecum étaient également situés à l'écart des neurones sensibles à l'étirement de l'estomac (Fig. 2b et Extended Data Fig. 7b, f). En général, les représentations d'organes dans le NTS reflétaient leurs positions physiques dans le corps, avec des organes plus antérieurs représentés dans la zone plus rostrolatérale du NTS (Fig. 2b, c). Ainsi, les entrées viscérales du tractus gastro-intestinal et des voies respiratoires supérieures sont organisées en une carte du tronc cérébral qui prend une forme analogue à un homoncule.

Contrairement à la séparation spatiale entre les représentations d'organes, plusieurs entrées d'un seul organe ont été observées à converger. Les neurones qui répondaient sélectivement au glucose intestinal et à l'étirement du duodénum étaient mélangés dans le même domaine et généralement séparés des neurones sensibles à l'étirement de l'estomac (Fig. 2d, e). De plus, les neurones NTS sensibles à l'étirement des régions intestinales plus éloignées du jéjunum présentaient une faible séparation spatiale des neurones sensibles à l'étirement duodénal, même si les applications de stimulation du jéjunum étaient distantes d'environ 40 et 90 mm des stimuli du duodénum (Fig. 2f – h). Cela contraste fortement avec les représentations plus séparées de l'étirement du duodénum et de l'estomac, qui n'étaient distantes que d'environ 3 mm. De même, les neurones sensibles à la distension de différentes régions de l'estomac distantes d'environ 3 mm présentaient également une faible séparation spatiale (données étendues Fig. 7g – i). Ainsi, les stimuli de différents organes peuvent être séparés tandis que différentes entrées du même organe peuvent converger. Les signaux mécanosensoriels du tractus gastro-intestinal sont représentés plus en évidence par l'organe que par la position absolue dans l'espace, ce qui suggère que le NTS utilise une carte discrète plutôt qu'une carte continue pour au moins certains stimuli viscéraux36.

Nous avons ensuite cherché à identifier les mécanismes qui sous-tendent la ségrégation spatiale des représentations viscérales dans le NTS. Tout d'abord, nous avons comparé les emplacements des axones sensoriels vagaux d'un organe avec le domaine NTS sensible à cet organe. L'imagerie calcique NTS a été réalisée sur des souris chez lesquelles les terminaisons présynaptiques des axones vagaux ont été visualisées en injectant AAV1-Cag-Flex-synaptophysine-Gfp dans l'estomac, l'intestin ou le larynx de souris Slc17a6-ires-cre (également appelées Vglut2- souris ires-cre), qui ont permis un accès génétique à > 99 % des neurones sensoriels vagaux7. Les terminaisons centrales des axones vagaux de chaque organe présentaient une certaine organisation dans le NTS, mais les neurones NTS sensibles aux stimuli de cet organe ne pouvaient pas être prédits uniquement par la position des terminaisons axonales correspondantes (Extended Data Fig. 8a – g). Les neurones sensoriels vagaux dans l'estomac, le larynx et l'intestin comprennent divers mécanorécepteurs et chimiorécepteurs avec différents modèles de ciblage NTS, nous avons donc imagé les réponses NTS tout en visualisant simultanément les axones de sous-types de neurones sensoriels vagaux génétiquement définis. En particulier, GLP1R et GPR65 marquent des populations discrètes de neurones sensoriels vagaux qui (1) fonctionnent principalement comme mécanorécepteurs et chimiorécepteurs intestinaux, respectivement, et (2) affichent des projections NTS spatialement discrètes8. Nous avons injecté des souris Glp1r-ires-cre ou Gpr65-ires-cre avec AAV1-Cag-Flex-synaptophysin-Gfp dans l'estomac et AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a dans le NTS. Nous avons observé que les neurones sensibles à l'étirement de l'estomac étaient plus proches des boutons axonaux des neurones GLP1R de l'estomac que des neurones GPR65 de l'estomac (Extended Data Fig. 8h – k). Cependant, les positions des axones vagaux et du soma NTS réactif n'étaient pas parfaitement alignées (Extended Data Fig. 8l). Ces résultats soulèvent la possibilité que le traitement d'ordre supérieur et l'organisation des dendrites dans le NTS contribuent également à la ségrégation des intrants.

Les neurones inhibiteurs contribuent à l'accentuation des réponses neuronales dans les régions du cerveau32,33, et les neurones inhibiteurs sont répartis sur l'ensemble du NTS (Extended Data Fig. 5). Pour examiner le rôle des neurones inhibiteurs dans la structuration des représentations viscérales, nous avons d'abord activé les neurones inhibiteurs dans le contexte de l'imagerie NTS. Nous avons injecté au NTS de souris Vgat-ires-cre;Rosa26-lsl-Gfp-L10a un AAV contenant un gène Cre-dépendant codant pour un récepteur designer (hM3Dq) sensible à la clozapine-N-oxyde (CNO) et un second AAV contenant un allèle H2b-jRGECO1a Cre-indépendant. Les réponses NTS ont été enregistrées dans les neurones GFP-négatifs à la stimulation viscérale avant et après l'injection de CNO chez la même souris. Nous avons observé que l'activation chimiogénétique des neurones inhibiteurs de NTS supprimait à la fois l'amplitude et le nombre de neurones répondant à la fois à l'étirement de l'estomac et du duodénum (Fig. 3a, b). Ce résultat est cohérent avec la notion selon laquelle l'inhibition locale contribue au déclenchement de l'entrée vagale37.

a, des souris Vgat-ires-cre;Rosa26-lsl-Gfp-L10a ont été injectées dans le NTS avec AAV8-Syn-DIO-HA-hM3dq-ires-mCitrine et AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a. L'imagerie NTS a été réalisée sur des neurones excitateurs GFP-négatifs avant et après l'administration de CNO (en bas). Les souris témoins (en haut) manquaient d'expression de hM3Dq et ont plutôt reçu une injection de solution saline. Les cartes thermiques décrivent les réponses à l'étirement de l'estomac (150, 300, 600 et 900 μl) et à l'étirement du duodénum (90, 115 et 140 μl). n = 869 neurones, 3 souris (en haut) ou 673 neurones, 5 souris (en bas). b, Variation moyenne du pic ΔF/F des neurones après injection de solution saline ou de CNO. Tailles des échantillons (de gauche à droite, en haut) : 726 neurones, 3 souris ; 507 neurones, 5 souris ; (de gauche à droite, en bas) : 94 neurones, 3 souris ; 92 neurones, 5 souris. ****P < 0,0001, test Mann-Whitney bilatéral. c, Cartes thermiques illustrant toutes les réponses NTS observées sans (en haut à gauche : 16 222 neurones, 103 souris ; en haut à droite : 7 919 neurones, 73 souris) ou avec (en bas à gauche : 1 168 neurones, 5 souris ; en bas à droite : 1 442 neurones, 5 souris) NTS -administration localisée de la bicuculline antagoniste des récepteurs GABAA. Les réponses ont été mesurées pour la distension gastrique (150 et 300 μl), la distension du duodénum (90, 115 et 140 μl) et la perfusion d'eau laryngée (100 μl), avec le pic ΔF/F de chaque neurone répondant normalisé à 100 %. Les neurones de chaque carte thermique sont triés en fonction de leur biais de réponse à l'étirement de l'estomac (en haut) par rapport à l'étirement du duodénum/l'eau laryngée (en bas). d, matrices de coefficients de corrélation de ΔF/F maximal pour chaque paire de stimuli sur tous les neurones réactifs de c (haut : 11 795 neurones, 73 souris ; bas : 1 806 neurones, 5 souris). e, Réponses (ΔF/F maximum au-dessus des seuils ; Méthodes) des neurones NTS de c. n = 400 neurones représentés au hasard par condition, 2 sur 1 600 hors plage. Barres blanches, 10 s (a,c).

Données source.

Nous avons ensuite bloqué l'inhibition en imageant les réponses neuronales NTS avec ou sans injection localisée NTS de la bicuculline antagoniste des récepteurs GABAA. Le blocage de l'inhibition a élargi les réponses NTS, provoquant la réponse de nombreux neurones à l'étirement de l'estomac et du duodénum ou à l'étirement de l'estomac et à l'eau laryngée (Fig. 3c – e). Le coefficient de corrélation moyen entre toutes les paires de stimuli provenant de différents organes est passé de -0,12 à 0,42 chez les animaux traités à la bicuculline. Un élargissement de la réponse a été observé de la même manière dans les neurones excitateurs et inhibiteurs (données étendues, Fig. 9). Comme indiqué précédemment38, le blocage des récepteurs GABAA dans le NTS a considérablement réduit le rythme respiratoire ; peut-être que l'engagement des circuits de contrôle de la respiration par des entrées sensorielles ectopiques contribue à modifier les schémas respiratoires.

Pour sonder comment l'inhibition est naturellement engagée, nous avons simultanément étiré l'estomac et le duodénum et comparé leurs réponses à la distension de chaque organe seul. Nous avons observé que la suppression était une caractéristique importante dans de nombreuses réponses neuronales. Les réponses à la distension du duodénum étaient systématiquement supprimées dans 29,0 % des neurones si l'estomac était simultanément distendu. Inversement, 17,4 % des neurones sensibles à l'estomac ont été inhibés par l'étirement du duodénum (Fig. 4a). La suppression de la réponse était dose-dépendante (Fig. 4b), avec un étirement accru de l'estomac conduisant à une suppression plus forte des réponses du duodénum. Les neurones sujets à l'inhibition ont été mêlés à d'autres neurones répondant au même stimulus, sans ségrégation positionnelle apparente (données étendues Fig. 10a). Des études d'inhibition croisée impliquant d'autres paires d'organes ont révélé que la distension gastrique supprimait de la même manière les réponses à la distension du jéjunum, mais était moins efficace pour supprimer les réponses de l'eau laryngée, suggérant au moins une certaine sélectivité dans l'inhibition croisée (données étendues Fig. 10). Ces résultats indiquent que les neurones NTS affichent une structuration spatiale marquée basée sur l'organe dont ils reçoivent les signaux. La structuration spatiale est améliorée au-delà de ce qui peut être réalisé par le tri des axones vagaux seul, et l'inhibition latérale est une caractéristique clé qui contribue au réglage sélectif d'au moins certains neurones NTS.

a, les réponses calciques ont été enregistrées dans les neurones NTS lors de l'application successive d'étirement de l'estomac (600 μl), d'étirement duodénal (115 μl) et d'étirement simultané de l'estomac et du duodénum, ​​la série de stimuli étant répétée et les réponses moyennées. Les neurones qui ont sélectivement détecté l'étirement duodénal (gauche, 176 neurones) ou l'étirement de l'estomac (droit, 544 neurones) ont été classés en deux groupes qui présentaient une inhibition de l'étirement simultané de l'estomac et du duodénum (mélange < simple ; gauche : 51 neurones ; droite : 94 neurones ) ou non (mélange ≈ simple ; gauche : 125 neurones ; droite : 450 neurones, 5 souris). Les traces moyennes (en haut) ou les cartes thermiques (en bas) des neurones répondants dans chaque classe sont représentées séparément, avec le pic ΔF/F de chaque neurone répondant normalisé à 100 %. Barre blanche, 10 s. b, Traces représentatives illustrant le ΔF/F normalisé au fil du temps pour les neurones individuels de a qui ont montré des réponses aux six stimuli décrits (à gauche) et une autre série de huit étirements duodénaux avec application simultanée de 0, 300, 600, 900, 900, 600, 300 et 0 ul d'étirement de l'estomac (à droite).

Les cartes neuronales sont des motifs de circuits caractéristiques utilisés par plusieurs systèmes sensoriels pour représenter différentes caractéristiques de stimulus4,5,6,35,39,40,41,42,43,44. Le regroupement spatial de neurones répondant de manière similaire facilite et économise vraisemblablement le câblage du circuit neuronal45. Certaines cartes codent la position du stimulus, comme les représentations somatosensorielles de l'homoncule ou des moustaches dans le cortex du baril du rongeur6,41 ; d'autres cartes codent l'identité ou la qualité du stimulus, telles que les cartes auditives qui rendent compte du ton et de la structure des sons, ou les cartes de couleurs dans le cortex visuel40,44. Ici, nous avons révélé une carte topographique frappante dans le tronc cérébral pour les entrées viscérales du tractus gastro-intestinal et du larynx, avec l'emplacement des neurones dans le tronc cérébral reflétant le site de sensation dans le corps. Nous avons également révélé un rôle clé de l'inhibition dans l'affinement des réponses NTS et l'amplification du contraste entre les neurones voisins qui transmettent des signaux viscéraux distincts. L'inhibition dans d'autres systèmes sensoriels permet un contraste de stimulus efficace et un contrôle descendant32. Ici, l'inhibition de blocage élargit le réglage neuronal, ce qui indique que de nombreux neurones NTS possèdent la capacité latente de traiter plusieurs flux d'informations.

La carte NTS provient de représentations neuronales distribuées dans les ganglions vagaux8,14. La genèse de l'organisation spatiale dans le tronc cérébral partage des similitudes avec le traitement périphérique dans le système olfactif, dans lequel les neurones sensoriels olfactifs primaires qui expriment le même récepteur chimiosensoriel sont distribués, et l'ordre spatial apparaît ensuite de novo dans le bulbe olfactif1,2. De plus, les réponses des neurones olfactifs de second ordre (cellules mitrales) sont principalement définies par l'espace, par le glomérule du bulbe olfactif qu'ils innervent et le récepteur olfactif dont ils reçoivent les entrées. Ici, nous avons montré que l'emplacement est également un facteur déterminant dans les réponses des neurones NTS. De nombreuses études importantes ont utilisé des outils génétiques pour délimiter les types de cellules NTS10, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Nous rapportons ici que chaque stimulus active un assortiment hétérogène de types de cellules NTS, bien que les fréquences des types de cellules recrutés peuvent varier selon les stimuli et sont particulièrement remarquables dans deux types de cellules avec des emplacements NTS régionalisés. Par conséquent, nous suggérons qu'il sera en outre important de considérer la position des cellules ainsi que l'identité transcriptionnelle pour comprendre les fonctions des neurones NTS. Nos données indiquent que le NTS contient des domaines définis dans l'espace pour des entrées sensorielles particulières, chaque domaine défini par entrée étant composé de types divers et communément partagés de cellules définies par le transcriptome. Nos résultats rappellent les cortex somatosensoriel et moteur et la moelle épinière, qui contiennent tous divers types de cellules répartis horizontalement sur des colonnes correspondant à des zones somatotopiques distinctes56,57,58.

À travers les systèmes sensoriels, les cartes peuvent changer de complexité à mesure que l'information monte à travers les circuits neuronaux. Les neurones du système visuel extraient des caractéristiques de stimulus de plus en plus complexes à mesure que les informations sont transmises de la rétine au cortex visuel3,4,5. En revanche, le système olfactif forme des cartes élaborées guidées par les récepteurs dans le bulbe olfactif mais rejette la structure spatiale dans le cortex olfactif1,2,43. Ici, nous avons montré que le système sensoriel intéroceptif génère également une organisation spatiale remarquable dans le tronc cérébral. Comprendre comment les cartes sont transformées et les principales caractéristiques de codage qui apparaissent ou se dissipent dans chaque région du cerveau est essentiel pour déterminer le rôle de cette région du cerveau dans les calculs de circuit, et plus généralement, comment le cerveau encode les informations.

Toutes les procédures animales ont suivi les directives éthiques décrites dans le NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, et tous les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de la Harvard Medical School. Les animaux ont été maintenus à température constante (23 ± 1 °C) et à humidité relative (46 ± 5 %) avec un cycle lumière-obscurité de 12 h. Les souris utilisées dans cette étude étaient des deux sexes et d'origine génétique mixte. Les souris Glp1r-ires-cre (029283), Gpr65-ires-cre (029282) et Crhr2-ires-cre (033728) étaient auparavant fabriquées en laboratoire et sont maintenant disponibles au Jackson Laboratory. Slc17a6-ires-cre (Vglut2-ires-cre, 028863), Slc32a1-ires-cre (Vgat-ires-cre, 028862), Rosa26-lsl-Gfp-L10a (024750), Tac1-ires-cre (021877), Souris Pdyn-ires-cre (027958), Penk-ires-cre (025112), Cartpt-ires-cre (028533), Sst-ires-cre (013044), Th-cre (021877) et Gcg-cre (030542) ont été achetés au Jackson Laboratory.

Pour construire l'AAV pour l'expression neuronale de jRGECO1a localisé au niveau nucléaire (AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a), la séquence codant pour jRGECO1a a été clonée à partir de pAAV-Syn-NES-jRGECO1a (Addgene, 100854) et insérée dans pAAV-Syn-H2b- Gcamp6f (Addgene, 74144) en remplaçant la séquence codant pour GCaMP6f. En bref, le gène jGRECO1a a été amplifié par PCR (amorce directe : ATAATAGGATCCACCAGTCGCCACCATGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGG ; amorce inverse : ATAATAAAGCTTCTCGAGTGGATCATTCGCAGAATTCTCTAGATCGCGAACTAGTGATCCGGTCACTTCGCTGTCATCATTTGTACAAACTC). Le produit de PCR jGRECO1 et pAAV-Syn-H2b-Gcamp6f ont été coupés (BamHI et HindIII) et ligaturés ensemble. Le plasmide résultant a été séquencé pour vérification et utilisé pour préparer le virus par le Boston Children's Hospital Viral Core Facility.

Les données transcriptomiques publiées31 de noyaux uniques du complexe vagal dorsal de souris ont été analysées (Extended Data Fig. 6) à l'aide de huit bibliothèques avec la plus grande profondeur de séquençage (31S, 20W, 34W, 14V, 36S, 40S, 39S et 25V), ce qui correspondait à 19 481 neurones, dont 13 630 neurones NTS. Des grappes neuronales ont été attribuées au NTS ou à d'autres régions caudales du tronc cérébral sur la base des modèles d'expression des gènes de signature révélés dans les données d'hybridation in situ de l'ARN provenant de l'Allen Brain Atlas. Les matrices de comptage des transcrits uniques pour chaque bibliothèque ont été normalisées à l'aide d'une régression binomiale négative régularisée avec la fonction SCTransform dans Seurat59. Les matrices de comptage transformées pour chaque bibliothèque ont ensuite été fusionnées, et l'analyse en composantes principales, la réduction dimensionnelle et l'identification des grappes ont été effectuées. L'analyse et la visualisation des données ont été effectuées à l'aide de Seurat (v.4.0.5) dans R (v.4.1.1)60,61.

De jeunes souris (âgées de 2 à 5 semaines) ont été anesthésiées (65 mg kg–1 kétamine, 13 mg kg–1 xylazine) et placées dans un cadre stéréotaxique pour petit animal (David Kopf Instruments). L'exposition directe au NTS a provoqué une inflammation tissulaire mineure mais inévitable, de sorte que le NTS a été accessible par injection oblique (25° par rapport à la perpendiculaire, incliné vers l'arrière). Trois injections (unilatérales) ou cinq injections (bilatérales) ont été faites à 0,36 mm, 0 mm et 0,12 mm latéralement à la ligne médiane et à 4,40 mm, 4,65 mm et 4,90 mm postérieurement au bregma, respectivement. Pour les jeunes souris, les distances bregma à lambda ont été mesurées et les coordonnées d'injection le long de l'axe rostral-caudal ont été mises à l'échelle pour correspondre aux coordonnées d'une distance bregma à lambda de 4, 2 mm. Une pipette en verre a été lentement abaissée à une profondeur de 4,8 à 5,0 mm pour l'injection la plus rostrale et de 4,3 à 4,8 mm pour les autres sites. Solutions virales contenant AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a (0,6–1,3 × 1013 génomes par ml), AAV8-Syn-DIO-HA-hM3dq-ires-mCitrine (Addgene 50454-AAV8, 1,9 × 1013 génomes par ml), AAV1- Syn-Gcamp6m (Penn Vector Core, CS1114, 7,0 × 1012 génomes par ml) ou AAV9-Cag-Flex-Gfp (Addgene 51502-AAV9, 3 × 1012 génomes par ml) ont été injectés (150 nl par injection, 2 nl s– 1) à l'aide d'un injecteur Nanoject III (Drummond). Les souris ont récupéré pendant 10 à 21 jours avant l'imagerie fonctionnelle. Des expériences de contrôle ont également été réalisées sur des animaux injectés avec des AAV à l'âge de 5 semaines, et des réponses NTS similaires ont été observées lors de l'imagerie in vivo (données étendues Fig. 1d – f).

AAV1-Cag-Flex-synaptophysin-Gfp a été conditionné par le Baylor College of Medicine Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Neuroconnectivity Core Facility et le Boston Children's Hospital Viral Core Facility. Les AAV de sérotype 1 marquent rétrogradement d'autres neurones sensoriels périphériques avec une grande efficacité62,63,64. De jeunes souris Vglut2-ires-cre, Gpr65-ires-cre ou Glp1r-ires-cre ont été anesthésiées (65 mg kg–1 kétamine, 13 mg kg–1 xylazine). L'estomac et le duodénum ont été exposés par une petite incision abdominale. Pour l'estomac, environ 40 injections (10 µl au total) d'AAV1-Cag-Flex-synaptophysine-Gfp ont été réalisées dans la paroi glandulaire de l'estomac à l'aide d'une seringue Hamilton. Pour le duodénum, ​​environ 5 injections (500 nl au total, 5 nl s-1) d'AAV1-Cag-Flex-synaptophysine-Gfp ont été réalisées dans les premiers 1 à 1,5 cm du duodénum à l'aide d'un injecteur Nanoject III (Drummond). Le larynx a été exposé à travers une petite incision médiane sur la face ventrale du cou, et le muscle sternohyoïdien a été rétracté. Environ 5 injections (300 nl au total, 5 nl s–1) ont été réalisées dans la paroi laryngée entre le bord antérieur du cartilage thyroïdien et le premier anneau sous le cartilage. Après l'injection, le tissu a été nettoyé avec une éponge chirurgicale pour absorber le liquide renversé. Les incisions ont été fermées avec des sutures et les souris ont récupéré pendant au moins 20 jours avant l'imagerie calcique.

Les souris ont été anesthésiées avec de l'uréthane (2 mg g–1 sur 2 injections intrapéritonéales à au moins 20 min d'intervalle et la chirurgie commençant au moins 20 min après la deuxième injection d'uréthane) ou avec une inhalation d'isoflurane (1,5–2,5 % tout au long de la procédure, quelques heures après la première injection intrapéritonéale injection avec 65 mg kg–1 de kétamine et 13 mg kg–1 de xylazine). Une anesthésie profonde a été assurée en évaluant le pincement des jambes et les réflexes cornéens au cours de l'expérience, avec de l'uréthane supplémentaire (0,2–0,6 mg g–1) administré au besoin. Les souris ont été réchauffées sur une plate-forme chauffée sur mesure, et une trachéotomie a été réalisée pour insérer un tube respiratoire. La chirurgie crânienne a été réalisée avec la tête fixée à un angle d'environ 30° vers le bas. Les muscles paraspinaux cervicaux ont été retirés, exposant le crâne et la première vertèbre cervicale. Le crâne au-dessus des lobules cérébelleux VI à IX a été coupé avec une fraise dentaire, et la partie postérieure du cervelet et environ les lobules VII à X ont été doucement aspirés pour exposer la surface dorsale du tronc cérébral. Après l'arrêt du saignement, une têtière en titane sur mesure a été montée sur le crâne parallèlement à la surface de l'area postrema. La partie antérieure du tenon a été fixée au crâne avec du ciment adhésif (C&B Metabond; Parkell), et la partie postérieure a été scellée à la peau avec de l'adhésif. Une petite goutte d'adhésif KwikSil (World Precision Instruments) a été appliquée à la surface du tronc cérébral, et une fenêtre crânienne en forme d'éventail, découpée dans une lamelle ronde (Warner Instruments, taille n° 0, 5 mm), a été abaissée jusqu'au surface du tronc cérébral. L'angle de la fenêtre crânienne a été ajusté de manière à ce qu'il soit parallèle à la surface de la zone postrema et une pression a été appliquée à l'aide d'un micromanipulateur (World Precision Instruments). Le flux sanguin dans la veine du pédoncule cérébelleux inférieur a été soigneusement surveillé, car une préparation stable exempte d'artefacts de mouvement nécessite qu'une pression suffisante soit appliquée à la fenêtre pour empêcher le flux sanguin à cette étape. La fenêtre crânienne a ensuite été fixée au crâne et à la tête avec du ciment Metabond. Le micromanipulateur a été retiré après le durcissement du ciment, tel que déterminé par une libération partielle de la pression sur le cerveau de sorte que le flux sanguin dans la veine du pédoncule cérébelleux inférieur n'était plus obstrué. Pour augmenter le taux de réussite de la chirurgie, les souris recevaient souvent une injection intraveineuse de PBS (300 μl) au début de la chirurgie et/ou recevaient de l'oxygène à travers un cône nasal.

L'imagerie calcique à deux photons a été réalisée avec un microscope à deux photons à balayage résonnant Olympus FVMPE équipé d'un objectif piézoélectrique Z-stepper (P-915, Physik Instrumente) et d'un objectif à immersion dans l'eau Olympus × 25 (NA de 1,0, WD de 8mm). Le logiciel Olympus FluoView a été utilisé pour collecter des images à deux photons. Un laser Ti: saphir avec compensation de dispersion (MaiTai eHP DeepSee, SpectraPhysics) a été réglé sur 975–1 020 nm, et l'émission de fluorescence a été filtrée avec un dichroïque passe-long de 570 nm et un filtre passe-bande de 495–540 nm pour les signaux GFP et GCaMP6m et un filtre passe-bande de 575 à 645 nm ou de 575 à 725 nm pour le signal jRGECO1a. L'imagerie volumétrique (1,25 Hz, résolution de 512 × 512 pixels) se composait généralement de cinq plans focaux distants de 80 ou 100 μm, couvrait une grande zone NTS (509,12 × 509,12 × 320 μm) et permettait l'enregistrement simultané d'environ 2 800 neurones par expérience. Les neurones dans les données étendues Fig. 1a – c ont été imagés sur un seul plan focal à 10–12, 5 Hz. La puissance laser mesurée à l'ouverture avant de l'objectif était de 35 à 90 mW et dépendait de la qualité de la fenêtre crânienne et de la profondeur d'imagerie. Les souris ont été soigneusement positionnées sur des pinces de tête pour un positionnement parallèle de la fenêtre crânienne et de la lentille frontale de l'objectif du microscope. Pour s'assurer que les axes anatomiques étaient alignés avec les détecteurs du microscope, les dimensions de lacet et de roulis ont été ajustées plus finement en utilisant la zone postrema comme point de repère.

Les distensions mécaniques des organes ont été obtenues par gonflage d'un ballon en latex (Braintree Scientific, 73–3479 pour l'estomac et 73–3478 pour tous les autres organes), comme décrit précédemment7. Une petite aiguille d'alimentation pour rongeurs (Cadence Science, 9920) a été fixée à l'intérieur du ballon et reliée à une seringue par un tube en silicone, ce qui a permis un contrôle précis du volume par infusion de liquide. La distension de la cavité buccale a été réalisée en gonflant un ballon placé dans la bouche contre la base crânienne. Pour la distension gastrique, le contenu de l'estomac a été retiré et une petite incision a été pratiquée dans la plus grande courbure de l'estomac glandulaire. Le ballon a été avancé dans l'antre de l'estomac et a été fixé par une suture autour du site d'incision. Dans Extended Data Fig. 7g – i, la distension antérieure de l'estomac impliquait le gonflage d'un ballonnet implanté dans le préestomac. La distension du duodénum a été obtenue en plaçant le ballonnet dans le bulbe du duodénum par une incision au niveau du sphincter pylorique et a été fixée au sphincter par une suture. Pour s'assurer que les stimuli mécaniques n'étaient isolés que du duodénum ou de l'estomac, une incision circulaire presque complète a été pratiquée autour du sphincter pylorique, puis une suture a été nouée autour du sphincter, ce qui a également empêché le déversement du contenu de l'estomac. Des ballonnets de jéjunum ont été placés dans l'intestin grêle à environ 40 mm (autour du ligament de Treitz) et à 90 mm en aval du sphincter pylorique. Des ballons de caecum ont été placés à travers une incision à la jonction caecum-côlon et fixés par une suture. Le tube fixé à tous les ballons a été fixé à la peau avec de l'adhésif. Pour les Fig. 4a, b et Extended Data Fig. 10, un étirement de l'estomac de 600 μl, un étirement du duodénum de 115 μl, un étirement du jéjunum de 115 μl et une perfusion d'eau laryngée de 8 s ont été appliqués à des souris avant l'imagerie.

Les perfusions laryngées étaient basées sur un protocole antérieur avec des modifications12. Une trachéotomie a été réalisée à environ cinq anneaux cartilagineux sous le cartilage thyroïde, et une canule (tube PE 50, Braintree Scientific) a été avancée à travers le site d'incision vers la glande thyroïde. Un anneau cartilagineux supplémentaire entre la canule de perfusion et le tube respiratoire a été retiré pour réduire la tension. Un adhésif silicone Kwik-Sil supplémentaire a été appliqué autour de la trachée, de la canule et du tube respiratoire pour sécuriser leurs positions, en évitant le déplacement mécanique pendant la stimulation, et de la colle tissulaire a été appliquée pour fixer la canule sur la peau. Pour les stimulations des Fig. 1g, h et des Figs de données étendues. 3h, i et 10, du PBS a été constamment et lentement perfusé à travers la canule laryngée à l'aide d'une pompe péristaltique. Pour la stimulation, le perfusat a été remplacé par une solution à haute teneur en sel (10 × PBS), 25 mM d'acide citrique (pH 2,6) ou de l'eau pendant 24 s (Fig. 1g, h et Extended Data Fig. 3h, i) ou pendant 8 s ( Données étendues Fig. 10) sans modifier le débit. Les intervalles entre les stimuli étaient de 96 s (Fig. 1g, h et Extended Data Fig. 3h, i) ou 40 s (Extended Data Fig. 10), et chaque stimulus était répété deux fois chez la même souris. Pour la stimulation laryngée dans d'autres figures, un bolus d'eau de 100 ul a été administré par une seringue reliée à la canule laryngée avec un tube en silicone.

Pour l'application de produits chimiques dans le duodénum, ​​des canules ont été insérées dans le bulbe du duodénum par une incision au niveau du sphincter pylorique et fixées avec une suture autour du sphincter. Un orifice de sortie, constitué d'un tube en silicone, a été créé à 1,5 cm en aval du sphincter. Des stimuli comprenant une solution saline (HBSS) et du glucose (0, 3 M dans HBSS) ont été administrés par des canules individuelles (100 μl sur 40 s). Les réponses salines ont été examinées à la fin de chaque session d'imagerie pour garantir l'absence de réponses de fond en raison de l'obstruction de l'orifice de sortie et de la distension mécanique associée (données étendues Fig. 4c, d).

Le méthiodide de bicuculline (Millipore-Sigma, 14343) a été injecté deux fois (chacune 100 pmol dans 50 nl de solution de Ringer, 3 nl s–1) à l'aide d'un injecteur Nanoject III, avec une injection à 100 μm sous l'obex et une seconde injection à 100 μm sous l'obex. surface du tronc cérébral environ 0,3 mm plus caudale et 0,3 mm plus latérale à l'obex. Les souris recevant des injections de bicuculline ou de CNO ont été ventilées mécaniquement pendant le reste de l'expérience, et l'imagerie a été réalisée dans les 30 minutes suivant l'injection de bicuculline. Le CNO (0,1 mg ml–1 dans du PBS, 2 mg kg–1 injection intrapéritonéale, Tocris) a été injecté 15 min avant l'imagerie calcique, et 1 souris (sur 9) qui ne présentait pas d'apnée induite par le CNO a été exclue. Une vagotomie sous-diaphragmatique (Fig. 1d) a été réalisée bilatéralement à l'aide de ciseaux à ressort (Fine Science Tools, 15000-04), avec des incisions au-dessus des branches hépatiques des nerfs vagaux gauche et droit. Des expériences d'imagerie calcique ont été réalisées sur des souris contenant divers allèles cre, et les résultats ont été regroupés.

Le mouvement latéral a été corrigé en enregistrant la série chronologique sur une image de référence à l'aide de Suite2P et/ou TurboReg65,66. Une image moyennée sur la série temporelle corrigée a été utilisée pour générer un modèle pour délimiter les contours des noyaux neuronaux marqués par jRGECO1a, qui ont été détectés semi-automatiquement à l'aide d'une routine de corrélation croisée normalisée rapide comme décrit précédemment. En bref, les images moyennées ont été corrélées avec un noyau d'une taille se rapprochant de celle d'un noyau moyen. L'image a ensuite été utilisée pour générer un masque binaire qui délimitait les noyaux marqués par jRGECO1a. Le masque a ensuite été examiné visuellement et les erreurs ont été corrigées manuellement. L'intensité de fluorescence (Ft) a été extraite en faisant la moyenne de l'intensité de tous les pixels dans les limites des régions d'intérêt. La fluorescence de base (F0) a été déterminée en faisant la moyenne de la fluorescence de jRGECO1a sur une période de 24 s avant le début de la stimulation, et l'écart type de cette période de base pré-stimulus (s0) a été déterminé. ΔF/F a été calculé comme suit :

Les traces ΔF/F ont été supprimées, à l'exception de la perfusion chimique duodénale, pour éliminer les effets non stationnaires tels que le photoblanchiment. Le seuil de réponse (θ) de chaque neurone a été fixé à 2,5 × s0 + F0. Un neurone était considéré comme affichant une réponse positive à un stimulus mécanique si ΔF/F pendant la période de stimulation était (1) supérieur à θ pendant plus de trois trames continues et (2) supérieur à deux fois l'écart type (s0′) au-dessus du intensité de fluorescence moyenne (F0 ') des sept images avant le début de la stimulation et θ pendant au moins deux images continues. Un neurone était considéré comme affichant une réponse positive à un stimulus chimique si ΔF/F pendant la période de stimulation plus les 20 images après le décalage du stimulus était (1) supérieur à θ pendant plus de quatre images continues et (2) supérieur à deux fois la norme écart (s0″) au-dessus de l'intensité de fluorescence moyenne (F0″) des 25 images avant le début de la stimulation et θ pendant au moins deux images continues. Les réponses ont été examinées manuellement, et rarement (2,94 %), les réponses ont été exclues en raison d'artefacts de mouvement, d'une dérive de base substantielle qui ne pouvait pas être corrigée par une suppression de la tendance ou par une obstruction physique du trajet de la lumière par des débris. Les réponses rapportées sur la Fig. 3c et les données étendues sur les Fig. 3f, g, i étaient maximales ΔF/F moins θ pendant la période correspondante (période de stimulation pour les stimuli mécaniques et période de stimulation plus les 20 images après décalage du stimulus pour les stimuli chimiques) après lissage le ΔF/F en utilisant une moyenne mobile de cinq trames. Dans des expériences impliquant du glucose duodénal, des champs de vision (FOV) avec au moins cinq neurones sensibles à chaque stimulus ont été utilisés pour une analyse plus approfondie. Pour toutes les autres expériences, des FOV avec au moins deux neurones sensibles à tous les stimuli analysés ont été utilisés.

Les distributions spatiales des neurones ont été représentées par rapport au centroïde de tous les neurones sensibles à l'étirement de l'estomac (Fig. 2b et données étendues Figs. 1, 7b, d et 8), les neurones sensibles à l'étirement du site 2 de l'estomac (données étendues Fig. 7h), neurones duodénaux sensibles au glucose (Fig. 2d), neurones duodénaux sensibles à l'étirement (Fig. 2g), neurones jRGECO1a-positifs, Cre-négatifs (Extended Data Fig. 6b), neurones à adaptation lente (Extended Data Fig. 2e) ou neurones non sensible à l'inhibition croisée (Extended Data Fig. 10) dans le même FOV. Les diagrammes de dispersion de densité (Fig. 2b, d, g et Extended Data Figs. 1e, h, 2e, 6b, 7b, d, h, 8c, d, i, j et 10a, d, g) ont été générés à l'aide d'un algorithm68 pour révéler la ségrégation entre les paires de stimulus. Ces parcelles comprennent des neurones qui ont été sélectivement activés par l'un des deux stimuli, et des échelles de couleurs représentent la densité de neurones qui ont répondu sélectivement au stimulus indiqué, ajusté individuellement entre différents organes. La ségrégation spatiale entre les neurones qui ont répondu à deux stimuli différents a été quantifiée (données étendues Fig. 7f) en utilisant toutes les distances par paires entre les neurones répondant au même stimulus ou à des stimuli différents, par rapport aux données d'une simulation dans laquelle les réponses des neurones ont été attribuées au hasard en fonction de la fréquence de réponse observée dans chaque FOV (mélangé) pour contrôler la variation régionale de la densité des neurones. De même, la ségrégation entre les neurones et les boutons (Extended Data Fig. 8l) a été quantifiée en utilisant toutes les distances par paires entre les mêmes structures (neurone à neurone ou bouton à bouton) ou différentes structures (neurone à bouton) et comparée avec données d'une simulation dans laquelle les identités des neurones ou des boutons ont été attribuées au hasard en fonction de la fréquence de réponse observée dans chaque FOV (mélangé). Nous avons utilisé un indice de ségrégation (SI) pour quantifier l'étendue de la ségrégation spatiale entre les neurones qui ont répondu à deux stimuli différents (Fig. 2e, h et Extended Data Fig. 7e, i) au sein des mêmes ensembles d'animaux. Le SI est calculé pour chaque neurone comme la différence entre la distance moyenne aux neurones avec des réponses différentes et la distance moyenne aux neurones avec des réponses similaires, normalisée par les distances des neurones après le brassage des réponses, et a été calculée comme suit. Dans la même image, X, Y désignent les emplacements des neurones qui répondent respectivement aux stimuli A et B. Pour simplifier, on écrit Z = (X1, …, Xn, Y1, …, Ym), et soit W l'ensemble de 1 000 permutations aléatoires indépendantes de {1, 2, …, n + m}. Le SI des neurones représentant le stimulus A par rapport aux neurones représentant le stimulus B est calculé comme suit :

Lors du calcul du SI sur plusieurs images, les données réelles moyennes (numérateur) des neurones de toutes les expériences ont été calculées avant d'être divisées par la moyenne des données mélangées (dénominateur). Pour l'analyse spatiale des paires de stimulus, des FOV contenant au moins deux neurones sélectivement accordés à chaque stimulus ont été utilisés pour une analyse plus approfondie. Étant donné que la taille des échantillons était variable sur la figure 2b, une analyse supplémentaire a été effectuée, impliquant une sélection aléatoire par ordinateur d'un nombre égal de souris pour chaque appariement de stimulus, et des résultats similaires ont été observés (données étendues, figure 7b).

Un indice d'enrichissement a été utilisé pour quantifier la composition relative des types de cellules NTS définis par Cre en réponse à chaque stimulus (données étendues Fig. 6d). Seuls les neurones sensibles à tout stimulus ont été inclus ; \({P}_{{{\rm{Cre}}}^{+}}\) est le pourcentage de neurones Cre positifs répondant au stimulus A, et \({P}_{{{\rm{Cre }}}^{-}}\) est le pourcentage de neurones Cre-négatifs répondant au stimulus A dans le même groupe d'animaux ; l'indice d'enrichissement a été calculé comme suit :

Pour la Fig. 4a, les réponses ont été mesurées dans l'ordre suivant : distension de l'estomac (dS1), distension duodénale (dD1), distension simultanée de l'estomac et du duodénum (dM1), deuxième distension de l'estomac (dS2), deuxième distension duodénale (dD2) et deuxième distension simultanée. distension gastrique et duodénale (dM2). Un neurone a été classé pour être supprimé par le mélange de stimulus uniquement si les critères suivants étaient remplis : (1) dM1 < dD1, (2) dM2 < dD2 et (3) (dM1 + dM2)/2 < dD2 pour les réponses du duodénum ; ou (1) dM1 < dS1, (2) dM2 < dS2 et (3) (dM1 + dM2)/2 < dS2 pour les réponses de l'estomac69. Les mêmes analyses ont été effectuées pour les expériences d'inhibition croisée impliquant l'eau laryngée et la distension du jéjunum dans Extended Data Fig. types ont été observés.

Pour les données étendues Fig. 8, la faible fluorescence de saignement de H2B-jRGECO1a dans le canal vert a été supprimée par calcul et par curation manuelle. Les bords des signaux GFP résiduels ont été détectés à l'aide de l'algorithme de détection des bords Canny, et les centroïdes de chaque bouton GFP-positif ont été déterminés et sélectionnés manuellement par un expérimentateur aveuglé aux propriétés de réponse neuronale ou à l'orientation de l'image. Les zones d'innervation ont été déterminées manuellement par un expérimentateur ignorant les réponses neuronales et le site d'injection du traceur. L'analyse a été effectuée sur le plan focal dans une pile d'imagerie avec les réponses neuronales les plus séparées. Les données provenant de neurones multiaccordés qui ont répondu à plus d'un stimulus ont été incluses dans tous les groupes de stimuli correspondants. Toutes les analyses ont été faites en aveugle aux réponses neuronales dans le FOV.

Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism (GraphPad Software), avec des tests statistiques et des tailles d'échantillons indiqués dans les légendes des figures. Toutes les répétitions sont biologiques et tous les tests statistiques sont bilatéraux. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille des échantillons, qui était basée sur l'expertise et les publications antérieures dans notre domaine8,14,34. Les enquêteurs n'ont pas été aveuglés à l'attribution des groupes, à l'exception de la détermination manuelle de l'innervation des axones (Extended Data Fig. 8), qui a été réalisée en aveugle à l'attribution des groupes et aux réponses neuronales. Aucune méthode de randomisation n'a été utilisée pour déterminer comment les animaux ont été répartis dans les groupes expérimentaux de la Fig. 3 et des données étendues Fig. 1d – i, et toutes les autres analyses impliquaient des comparaisons de stimuli chez les mêmes animaux. Dans les Fig. 1f, h et 3b, les coefficients de corrélation de Pearson ont été calculés pour chaque paire de stimulus en comparant les valeurs maximales de ΔF/F sur tous les neurones sensibles à tout stimulus dans les figures correspondantes.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données d'imagerie brutes sont disponibles sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

Seurat (4.0.5), R (4.1.1), ImageJ (1.52q), Matlab (R2020a), Processing (4.0a3), Python (3.9.4), OpenCV (4.5.1) et GraphPad Prism (9.0. 2) ont été utilisés pour l'analyse des données. Tout le code généré sera mis à disposition sur demande raisonnable.

Une correction à cet article a été publiée : https://doi.org/10.1038/s41586-022-05414-5

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Xu, L. et al. Modulation généralisée axée sur les récepteurs dans le codage olfactif périphérique. Sciences 368, eaaz5390 (2020).

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Nous remercions S. Arber pour fournir le vecteur pAAV-Cag-Flex-synaptophysin-Gfp ; R. Brust, Y. Wang, J. Zhu, G. Mahler et le personnel du centre d'imagerie cellulaire de l'hôpital pour enfants de Boston pour leur aide dans les expériences ; et Q. Zhao, W. Su, M. Schappe, S. Prescott, C. Zhang et M. Hayashi pour leurs commentaires sur le manuscrit. Le travail a été soutenu par des subventions du NIH à SDL (DP1 AT009497, R01 DK122976 et R01 DK103703), la Food Allergy Science Initiative et une bourse postdoctorale Leonard et Isabelle Goldenson, un Harvard Brain Science Initiative Young Investigator Transitions Award et une American Diabetes Association La bourse postdoctorale au CRSDL est un chercheur du Howard Hughes Medical Institute.

Département de biologie cellulaire, Howard Hughes Medical Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Chen Ran, Jack C. Boettcher, Judith A. Kaye, Catherine E. Gallori et Stephen D. Liberles

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CR et SDL ont conçu les expériences. CR a effectué toutes les expériences. CR, JCB et CEG ont analysé les données d'imagerie spécifiques au type de cellule et de traçage des axones vagaux. JAK a analysé les données de séquençage de l'ARN à noyau unique. CR a analysé toutes les autres expériences. CR et SDL ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Stephen D. Liberles.

SDL est consultant pour Kallyope. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Alexander Chesler, Ulrika Marklund et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, des souris ont été injectées dans le NTS avec des AAV codant pour H2B-jRGECO1a et GCaMP6m, et une imagerie NTS a ensuite été réalisée pour mesurer les transitoires calciques évoqués par la distension gastrique. Une carte thermique illustrant les réponses résolues dans le temps des 74 neurones NTS (2 souris) qui affichaient à la fois les réponses H2B-jRGECO1a (à gauche) et GCaMP6m (à droite) à une série de distensions gastriques (barres vertes d'épaisseur croissante : 150, 300, 600 , et 900 μl), barre blanche : 10 s. b, Traces représentatives illustrant le ΔF/F normalisé au fil du temps pour les neurones individuels (mêmes neurones à gauche et à droite), barre d'échelle : 10 s. c, ΔF/F maximal des neurones NTS répondant à une distension gastrique de 900 μl. d, Des souris ont été injectées dans le NTS avec un AAV codant pour H2B-jRGECO1a à 2 (gauche) et 5 (droite) semaines d'âge, et l'imagerie NTS a ensuite été réalisée. Images représentatives à deux photons de la fluorescence H2B-jRGECO1a dans le NTS (vue transversale). Les neurones sont codés par couleur en fonction de leurs amplitudes de réponse maximales relatives au-dessus du seuil à l'eau laryngée (bleu, 100 μl), à l'étirement de l'estomac (vert, réponse maximale à 150, 300, 600 ou 900 μl) ou à l'étirement duodénal (rouge, pic réponse à 90, 115 ou 140 μl), barre d'échelle : 100 μm. e, les positions des neurones sélectivement sensibles aux stimuli indiqués sont tracées avec l'origine de l'axe correspondant au centre de gravité des neurones sensibles à l'étirement de l'estomac, en haut à gauche : 695 neurones, 4 souris, en bas à gauche : 1106 neurones, 4 souris, en haut à droite : 2331 neurones, 8 souris, en bas à droite : 2215 neurones, 6 souris, l'échelle de couleurs représente la densité neuronale (voir méthodes), longueur de l'axe : 150 μm, R : rostral, M : médial. f, quantification du pourcentage de neurones individuellement réglés sur la distension gastrique, la distension du duodénum ou l'eau laryngée, points : souris individuelles, n : 4 (gauche), 8 (droite), moyenne ± sem. g, Images représentatives à deux photons de la fluorescence H2B-jRGECO1a dans le NTS (vue transversale) de souris anesthésiées à l'uréthane (2,2 à 2,6 mg/mg) ou à l'isoflurane (1,5 % à 2,5 %). Les neurones sont codés par couleur en fonction de leurs amplitudes de réponse maximales relatives au-dessus du seuil à l'eau laryngée (bleu, 100 μl), à l'étirement de l'estomac (vert, réponse maximale à 150, 300, 600 ou 900 μl) ou à l'étirement duodénal (rouge, pic réponse à 90, 115 ou 140 μl), barre d'échelle : 100 μm. h, les positions des neurones répondant sélectivement aux stimuli indiqués sont tracées avec l'origine de l'axe correspondant au centre de gravité des neurones sensibles à l'étirement de l'estomac, en haut à gauche : 1 136 neurones chez 8 souris sélectionnées au hasard parmi 49 souris, en bas à gauche : 2 525 neurones chez 9 souris sélectionnées au hasard à partir de 98 souris, en haut à droite : 1010 neurones, 8 souris, en bas à droite : 1707 neurones, 9 souris, l'échelle de couleurs représente la densité des neurones (voir méthodes), longueur de l'axe : 150 μm, R : rostral, M : médial. i, Quantification du pourcentage de neurones individuellement réglés sur la distension gastrique, la distension du duodénum ou l'eau laryngée, points : souris individuelles, n : 63 (gauche), 10 (droite), moyenne ± sem.

Données source

a, Carte thermique illustrant les réponses résolues dans le temps (code couleur basé sur le pourcentage d'augmentation de la fluorescence ΔF/F de jRGECO1a par rapport à la ligne de base) de tous les 81 (1 souris) neurones NTS répondant à dix distensions gastriques consécutives (barres vertes). Chaque ligne montre la réponse d'un neurone individuel, avec des lignes triées par amplitude de réponse, barre blanche : 10 s. b, Un graphique classé par ordre de pic ΔF/F pour les 81 neurones représentés sur la Fig. 1c, cercles gris : amplitudes de réponse maximale des essais individuels ; cercles rouges : moyennes des amplitudes de réponse maximales à travers les essais. c, Traces représentatives illustrant le ΔF/F normalisé au fil du temps pour les neurones individuels à l'étirement répété de l'estomac (600 μl, taux de distension : ~ 25 μl/s pour les essais n° 1 et n° 3, et ~ 300 μl/s pour les essais n° 2 et n° 4), barre d'échelle : 10 s. d, un histogramme illustrant la durée de réponse (pleine largeur au quart maximum) des neurones à adaptation lente (vert) et à adaptation rapide (jaune) sur la figure 1c. e, Une image représentative à deux photons de la fluorescence H2B-jRGECO1a dans le NTS (vue transversale) avec des neurones pseudocolorés en fonction de leur adaptation lente (verte) ou rapide (jaune) à l'étirement de l'estomac, barre d'échelle : 100 μm. f, Positions des neurones qui s'adaptent lentement (vert, 544 neurones) ou rapidement (jaune, 650 neurones) à l'étirement de l'estomac, avec l'origine de l'axe correspondant au centroïde pour l'adaptation lente des neurones, 19 souris, l'échelle de couleur représente la densité neuronale (voir méthodes) , longueur de l'axe : 200 μm, R : rostral, M : médial. g, pourcentage de neurones activés par l'étirement de l'estomac à adaptation lente (vert, 289 neurones chez 13 souris) et à adaptation rapide (jaune, 493 neurones chez 13 souris) qui ont également répondu à l'étirement du duodénum (90, 115 ou 140 μl). h, Réponses des neurones à adaptation lente (vert, 316 neurones chez 13 souris) et à adaptation rapide (jaune, 518 neurones chez 13 souris) à diverses amplitudes de distension gastrique ; ΔF/F maximal normalisé à 100 % pour chaque neurone, moyenne ± sem.

Données source

a, Traces représentatives illustrant le ΔF/F normalisé au fil du temps pour les neurones individuels de la Fig. 1e. b, Le pourcentage de neurones de la Fig. 1e qui répondent sélectivement à différentes entrées d'organes ou affichent des réponses multi-réglées. c, diagramme circulaire illustrant les neurones de la Fig. 1e répondant aux stimuli de 1 (accord unique) ou> 1 (multi-accord). d, Le pourcentage de neurones multi-réglés sur la Fig. 1e à diverses paires de stimuli. e, Le pourcentage de neurones accordés individuellement dans chaque souris imagée (cercles) de la Fig. 1e, moyenne ± sem. f, Réponses (ΔF/F maximum au-dessus des seuils) des neurones qui ont répondu à tout étirement de l'estomac et/ou à toute stimulation dans d'autres organes. Chaque graphique représente les réponses de 300 neurones choisis au hasard parmi 3815 neurones, 21 souris (orale contre estomac), parmi 18895 neurones, 73 souris (larynx contre estomac), parmi 35120 neurones, 113 souris (duodénum contre estomac), parmi 21653 neurones, 84 souris (jéjunum vs estomac) et à partir de 4414 neurones, 22 souris (caecum vs estomac). g, Réponses (AF/F maximum au-dessus des seuils) des neurones qui ont répondu à 600 ml ou 900 ml d'étirement de l'estomac (300 neurones choisis au hasard parmi 27125 neurones, 103 souris). h, Traces représentatives illustrant le ΔF/F normalisé au fil du temps pour 13 neurones individuels de la Fig. 1g, barre d'échelle : 10 s. i, Réponses (ΔF/F maximum au-dessus des seuils, voir méthodes) de 362 (gauche), 404 (milieu) et 467 (droite) neurones NTS réactifs de la Fig. 1g. Les réponses maximales provenaient d'un essai (à gauche) ou correspondaient à la réponse la plus importante de deux essais (au milieu, à droite).

Données source

a, cartes thermiques illustrant les réponses résolues dans le temps de tous les neurones NTS répondants à diverses amplitudes d'étirement du duodénum (en haut, 271 neurones) et d'étirement du jéjunum (en bas, 118 neurones), 6 souris, barre blanche : 10 secondes. b, pic ΔF/F des neurones dans a qui ont répondu aux stimuli indiqués, test F pour une pente non nulle : **** P < 0,0001. c, Carte thermique illustrant les réponses résolues dans le temps des 74 neurones NTS répondants (2 souris) à la perfusion duodénale (24 s) de glucose (300 mM dans HBSS, violet) et de solution saline (HBSS, olive), barre d'échelle : 10 s . d, carte thermique illustrant les réponses résolues dans le temps de tous les 492 neurones NTS répondants (2 souris) à la perfusion duodénale de glucose (300 mM, violet foncé), à l'étirement du duodénum (rouge : 140 μl) et à l'étirement de l'estomac (600 μl, vert ), barre blanche : 10 s.

Données source

ac, des souris Vgat-ires-Cre ont été injectées dans le NTS avec AAV9-Cag-Flex-Gfp et AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a et préparées pour l'imagerie à deux photons in vivo. a, Une image représentative de la fluorescence native de H2B-jRGECO1a (magenta) et GFP (vert, représentant les neurones Vgat) est montrée, barre d'échelle : 100 μm. Des ajustements d'image non linéaires ont été effectués pour assurer la visualisation de toutes les cellules vertes. b, Carte thermique illustrant les réponses résolues dans le temps de tous les 1933 neurones NTS Vgat-négatifs (à gauche) et 206 Vgat-positifs (à droite) chez 7 souris à la perfusion d'eau laryngée (bleu foncé), à l'étirement de l'estomac (vert, épaisseur croissante : 150, 300, 600 et 900 μl) et distension du duodénum (rouge, épaisseur croissante : 90, 115 et 140 μl), barre blanche : 10 s. c, diagrammes circulaires illustrant les pourcentages de neurones Vgat-négatifs et Vgat-positifs répondant aux stimuli indiqués. df, des souris Vgat-ires-Cre ont été croisées avec des souris Rosa26-lsl-Gfp-L10a et préparées pour l'imagerie in vivo à deux photons. d, Une image représentative de la fluorescence native de H2B-jRGECO1 (magenta) et GFP (vert, représentant les neurones Vgat) est montrée, barre d'échelle : 100 μm. Des ajustements d'image non linéaires ont été effectués pour assurer la visualisation de toutes les cellules vertes. e, Carte thermique illustrant les réponses résolues dans le temps de tous les 766 neurones NTS Vgat-négatifs (à gauche) et 402 Vgat-positifs (à droite) chez 5 souris à la perfusion d'eau laryngée (bleu foncé), à l'étirement de l'estomac (vert, épaisseur croissante : 150, 300, 600 et 900 μl) et distension du duodénum (rouge, épaisseur croissante : 90, 115 et 140 μl), barre blanche : 10 s. f, diagrammes circulaires illustrant les pourcentages de neurones Vgat-négatifs et Vgat-positifs répondant aux stimuli indiqués.

a, l'imagerie NTS a été réalisée sur des souris contenant un allèle Gfp Cre-dépendant et les allèles Cre indiqués. Images représentatives de la fluorescence native H2B-jRGECO1 (magenta) et GFP (vert), ajustements d'image non linéaires effectués pour assurer la visualisation de toutes les cellules vertes, barre d'échelle : 100 μm. b, Positions des neurones GFP-positifs, H2B-jRGECO1a-positifs (vert) et GFP-négatifs, H2B-jRGECO1a-positifs (magenta), avec l'origine de l'axe correspondant au centroïde des neurones GFP-négatifs, H2B-jRGECO1a-positifs. Nombre de neurones verts/rouges de 5 souris Th-Cre : 354/11748, 3 souris Cartpt-ires-Cre : 106/8235, 4 souris Calcr-ires-Cre : 756/6911, 3 souris Pdyn-ires-Cre : 1 /6747, 7 souris Tac1-ires-Cre : 456/15016, 4 souris Penk-ires-Cre : 1326/8635, 3 souris Gcg-Cre : 478/11122, 3 souris Sst-ires-Cre : 812/7149, et 5 Souris Crhr2-ires-Cre : 398/14377, échelle de couleurs représentant la densité neuronale (voir méthodes), longueur de l'axe : 200 μm, R : rostral, M : médial. c, diagrammes circulaires illustrant les pourcentages de neurones réactifs GFP-négatifs, H2B-jRGECO1a-positifs (en haut) et GFP-positifs, H2B-jRGECO1a-positifs (en bas) répondant à l'étirement de l'estomac, à l'étirement du duodénum ou aux deux (multi-réglé) . d, Un indice d'enrichissement quantifie la composition relative des types de cellules NTS définies par Cre en réponse à chaque stimulus (voir Méthodes). e, Terrain d'approximation et de projection uniformes de variété (UMAP) indiquant les sous-types de neurones NTS basés sur des données publiées sur le transcriptome unicellulaire31. f, Dot plots montrant l'expression normalisée des gènes indiqués dans 24 sous-types de neurones NTS de e.

Données source

a, image représentative à deux photons de la fluorescence H2B-jRGECO1a dans le NTS (vue transversale), avec des neurones codés par couleur en fonction de leurs amplitudes de réponse maximales relatives au-dessus du seuil de pincement des jambes (rouge) et d'étirement de l'estomac (vert, 150, 300 successifs , distensions de 600 et 900 μl), barre d'échelle : 100 μm. b, les positions des neurones répondant sélectivement aux stimuli indiqués sont représentées sur la figure 3b, avec une analyse ici impliquant 9 souris sélectionnées au hasard de la figure 3b pour égaliser la taille de l'échantillon, oral/estomac : 925 neurones, larynx/estomac : 1128 neurones, duodénum /estomac : 2347 neurones, jéjunum/estomac : 1153 neurones, caecum/estomac : 415 neurones (mêmes données que Fig. 3b), échelle de couleurs représentant la densité neuronale (voir méthodes), longueur de l'axe : 150 μm, R : rostral, M : médian. c, images représentatives à deux photons à différentes profondeurs de fluorescence H2B-jRGECO1a dans le NTS (vue transversale), avec des neurones codés par couleur en fonction de leurs amplitudes de réponse maximales relatives au-dessus du seuil d'étirement de l'estomac (vert, successif 150, 300, 600, et distensions de 900 μl) et étirement du duodénum (rouge, distensions successives de 90, 115 ou 140 μl), barre d'échelle : 100 μm. d, les positions des neurones à différentes profondeurs répondant sélectivement aux stimuli comme décrit en c sont tracées avec l'origine de l'axe correspondant au centroïde pour les neurones sensibles à l'étirement de l'estomac, 0 μm : 455 neurones, 17 souris, 80 μm : 2 517 neurones, 46 souris, 160 μm : 4909 neurones, 53 souris, 240 μm : 4445 neurones, 52 souris, 320 μm : 2204 neurones, 39 souris, l'échelle de couleur représente la densité des neurones, longueur de l'axe : 150 μm, R : rostral, M : médial. e, quantification de la ségrégation spatiale des neurones en d, moyenne ± sem, voir méthodes pour l'indice de ségrégation. f, Distances par paires entre les neurones sensibles au même stimulus (coloré) ou à des stimuli différents (noir). Les données de la Fig. 3b (réelles) ont été comparées aux données d'une simulation où les réponses des neurones ont été attribuées au hasard en fonction de la fréquence de réponse observée dans chaque champ de vision (mélangé) pour contrôler la variation régionale de la densité des neurones, oral/estomac : 1204 neurones , 11 souris, larynx/estomac : 10610 neurones, 57 souris, duodénum/estomac : 28556 neurones, 107 souris, jéjunum/estomac : 13050 neurones, 66 souris, caecum/estomac : 415 neurones, 9 souris, moyenne ± sem, ## ##P < 0,0001, interaction significative dans l'analyse bidirectionnelle de la variance entre les types de répondeurs et le brassage, ****P < 0,0001, test de comparaisons multiples de Šídák. g, dessin animé illustrant les sites de distension du ballon dans le tractus gastro-intestinal. h, les positions des neurones sensibles aux stimuli indiqués sont représentées graphiquement par rapport au centroïde (origine des coordonnées) des neurones sensibles à la distension de l'estomac site 2, gauche : 1155 neurones, 4 souris, droite : 927 neurones, 4 souris, longueur de l'axe : 150 μm , R : rostral, M : médial. i, Quantification de la ségrégation spatiale des neurones en h répondant aux stimuli indiqués, moyenne ± sem, **** P < 0,0001, test de Mann-Whitney bilatéral, voir méthodes pour l'indice de ségrégation.

Données source

a, dessin animé illustrant l'imagerie à deux photons NTS chez des souris Vglut2-ires-Cre injectées avec AAV1-Cag-Flex-Synaptophysin-Gfp dans le larynx (en haut), l'estomac (au milieu) et le duodénum (en bas), et AAV1-Syn- H2b-jRGECO1a dans le NTS. b, Gauche : images représentatives à deux photons (vue transversale) des noyaux neuronaux NTS (rouge, jRGECO1a) et des boutons des axones vagaux des organes indiqués (vert, Synaptophysin-GFP). À droite : les mêmes images avec des neurones NTS codés par couleur en fonction de leurs amplitudes de réponse maximales relatives au-dessus du seuil à l'eau laryngée (100 μl, bleu), à l'étirement de l'estomac (vert, distensions successives de 150, 300, 600 et 900 μl) et duodénal étirement (rouge, distensions successives de 90, 115 et 140 μl), R : rostral, M : médial, barre d'échelle : 100 μm. c, Positions des boutons de l'axone vagal du larynx (rangée du haut, bleu foncé, 489 boutons, 3 souris), de l'estomac (rangée du milieu, vert foncé, 966 boutons, 3 souris) et du duodénum (rangée du bas, rouge foncé, 891 boutons , 5 souris) sont tracées avec les positions des neurones NTS répondant sélectivement à 100 μl d'eau laryngée (colonne de gauche, bleu), toute distension (150, 300, 600 ou 900 μl) de l'estomac (2e colonne de gauche, vert), toute distension (90, 115 ou 140 μl) du duodénum (2e colonne de droite, rouge) ou toute distension (90, 115 ou 140 μl) du jéjunum (colonne de droite, orange). Neurones représentés de haut en bas : larynx 24, 54, 57, estomac 209, 364, 555, duodénum 91, 92, 109, jéjunum 69, 59, 58, origine de l'axe : centre de gravité des neurones sensibles à l'étirement de l'estomac, longueur de l'axe : 150 μm , R : rostral, M : médial. d, Positions des boutons de l'axone vagal à partir de c avec l'origine de l'axe correspondant au centre de gravité des neurones sensibles à l'étirement de l'estomac, longueur de l'axe : 150 μm, R : rostral, M : médial. e, Les pourcentages de boutons d'axones vagaux du larynx (en haut), de l'estomac (au milieu) et du duodénum (en bas) en c qui sont situés dans un rayon variable de tout neurone sensible aux stimuli indiqués, moyenne ± sem. f, Distances entre les neurones NTS sensibles aux stimuli indiqués et les boutons les plus proches des axones vagaux du larynx (en haut), de l'estomac (au milieu) et du duodénum (en bas), moyenne ± sem. g, les pourcentages de neurones NTS sensibles aux stimuli indiqués qui sont situés dans la zone d'innervation (voir méthodes) des axones vagaux de différents organes. h, Gauche : images représentatives à deux photons (vue transversale) des noyaux neuronaux NTS (rouge, jRGECO1a) et des boutons des axones vagaux (vert, Synaptophysin-GFP) visualisés en injectant AAV1-Cag-Flex-Synaptophysin-Gfp dans l'estomac de Souris Vglut2-ires-Cre (en haut), Glp1r-ires-Cre (au milieu) ou Gpr65-ires-Cre (en bas), barre d'échelle : 100 μm. À droite : les mêmes images avec des neurones NTS colorés en vert pour indiquer les neurones sensibles à la distension de l'estomac. i, Positions des boutons axonaux (vert foncé) des neurones de l'estomac marqués dans Vglut2-ires-Cre (haut, 966 boutons, 3 souris, mêmes données que c), Glp1r-ires-Cre (milieu, 1276 boutons, 3 souris), ou souris Gpr65-ires-Cre (en bas, 243 boutons, 3 souris) et comparées aux positions des neurones NTS sensibles à l'étirement de l'estomac, origine de l'axe : centroïde pour les neurones sensibles à l'étirement de l'estomac, en haut : 364 neurones (mêmes données que c) , milieu : 539 neurones, bas : 244 neurones, longueur de l'axe : 150 μm, R : rostral, M : médial. j, positions des boutons axonaux de i. k, Distances entre les neurones NTS sensibles à l'étirement de l'estomac et les boutons les plus proches des axones vagaux de l'estomac des souris Vglut2-ires-Cre (mêmes données que dans f), Glp1r-ires-Cre et Gpr65-ires-Cre, moyenne ± sem, **P < 0,01, ****P < 0,0001, test de comparaisons multiples de Dunn suivant le test de signification de Kruskal-Wallis. l, Les distances par paires ont été calculées entre les neurones NTS sensibles à l'étirement de l'estomac et les boutons axonaux des neurones de l'estomac des lignes Cre indiquées (noir) et comparées à une moyenne des distances par paire bouton-bouton et des différences par paire neurone NTS-neurone NTS (vert). Les données réelles ont été comparées aux données d'une simulation où l'identité du bouton ou du neurone NTS a été attribuée au hasard en fonction de la fréquence observée dans chaque champ de vision (mélangé) pour contrôler la variation régionale de la densité des neurones ou du bouton, moyenne ± sem, ###P < 0,001, ####P < 0,0001, interaction significative dans l'analyse bidirectionnelle de la variance entre les types de répondeurs et le brassage, ****P < 0,0001, test de comparaisons multiples de Šídák.

Données source

a, Vgat-ires-CRE ; Des souris Rosa26-lsl-Gfp-L10a ont été injectées dans le NTS avec AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a, et une imagerie NTS in vivo a été réalisée avec (en bas) ou sans (en haut) administration localisée de bicuculline dans le NTS. Les cartes thermiques illustrent les réponses résolues dans le temps des neurones Vgat-positifs (à gauche) et Vgat-négatifs (à droite) à l'eau laryngée (bleu foncé, 100 μl), à l'étirement de l'estomac (vert, épaisseur croissante : 150, 300, 600 et 900 μl) et/ou distension du duodénum (rouge, épaisseur croissante : 90, 115 et 140 μl). En haut : 402 neurones Vgat-positifs et 766 Vgat-négatifs, 5 souris, mêmes données que Extended Data Fig. 5e ; bas : 365 neurones Vgat-positifs et 851 neurones Vgat-négatifs, 2 souris, barre blanche : 10 s. b, diagrammes circulaires illustrant les pourcentages de neurones Vgat-positifs (à gauche) et Vgat-négatifs (à droite) de c répondant aux stimuli indiqués avec (en bas) ou sans (en haut, mêmes données que les données étendues Fig. 5f) administration de bicuculline. c, Le pourcentage de neurones Vgat-positifs et Vgat-négatifs provenant d'un test χ2 bilatéral répondant aux stimuli de > 1 organe (multi-réglé), **** P < 0,0001.

Données source

a, Positions des neurones de la Fig. 4a répondant sélectivement à l'étirement du duodénum (en haut) ou à l'étirement de l'estomac (en bas), avec une coloration différentielle basée sur la sensibilité à l'inhibition latérale, origine de l'axe : centroïde pour les neurones non inhibés, longueur de l'axe : 150 μm, R : rostral, M : médial. b, suppression de la réponse dans les paires de stimulus indiquée mesurée sur une base par animal dans les neurones qui ont reçu une inhibition induite par la double stimulation (Mix < simple, droite) ou non (Mix ≈ simple, gauche), points de données : changements de réponse moyens de tous neurones chez une seule souris, 5 souris. c, Traces moyennes (en haut) ou cartes thermiques (en bas) des réponses neuronales NTS normalisées et résolues dans le temps à l'application successive de l'étirement de l'estomac (vert, 600 μl), de l'étirement jéjunal (jaune, 115 μl) et des deux. Les neurones qui détectaient sélectivement l'étirement du jéjunum (gauche, 378 neurones) ou l'étirement de l'estomac (droite, 1183 neurones) ont été classés en deux groupes étaient une double stimulation évoquée par inhibition (Mix < simple ; gauche : orange, 125 neurones, droite : vert clair, 124 neurones ) ou non (Mix ≈ single ; gauche : gris, 253 neurones, droite : vert foncé, 1059 neurones, 8 souris), barre blanche : 10 s. d, Positions des neurones de c sélectivement sensibles à l'étirement du jéjunum (à gauche) ou à l'étirement de l'estomac (à droite), avec une coloration différentielle basée sur la sensibilité à l'inhibition latérale, origine de l'axe : centroïde pour les neurones non inhibés, longueur de l'axe : 150 μm, R : rostral, M : médial. e, Suppression de la réponse dans les paires de stimulus indiquée mesurée sur une base par animal dans les neurones qui ont reçu une double inhibition évoquée par stimulation (Mix < simple, droite) ou non (Mix ≈ simple, gauche), points de données : changements de réponse moyens de tous neurones chez une seule souris, 7 souris. f, Traces moyennes (en haut) ou cartes thermiques (en bas) des réponses neuronales NTS normalisées et résolues dans le temps à l'application successive de l'étirement de l'estomac (vert, 600 μl), de l'eau laryngée (bleu) et des deux. Les neurones qui détectaient sélectivement l'eau laryngée (gauche, 119 neurones) ou l'étirement de l'estomac (droite, 243 neurones) ont été classés en deux groupes étaient une double stimulation évoquée par inhibition (Mix < simple ; gauche : bleu clair, 13 neurones, droite : vert clair, 37 neurones) ou non (Mix ≈ single ; gauche : bleu foncé, 106 neurones, droite : vert foncé, 206 neurones, 3 souris), barre blanche : 10 s. g, Positions des neurones de f sélectivement sensibles à l'eau laryngée (à gauche) ou à l'étirement de l'estomac (à droite), avec une coloration différentielle basée sur la sensibilité à l'inhibition latérale, origine de l'axe : centroïde pour les neurones non inhibés, longueur de l'axe : 150 μm, R : rostral, M : médial. h, Suppression de la réponse dans les paires de stimulus indiquée mesurée sur une base par animal dans les neurones qui ont reçu une double inhibition évoquée par stimulation (Mix < simple, droite) ou non (Mix ≈ simple, gauche), points de données : changements de réponse moyens de tous neurones chez une seule souris, 3 souris, moyenne ± sem, *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001, test de comparaisons multiples de Šídák.

Données source

Imagerie NTS in vivo chez la même souris avec (gauche) ou sans (droite) anesthésie à l'isoflurane.

Imagerie calcique à deux photons in vivo montrant la structuration spatiale des réponses des neurones NTS à la distension de l'estomac, à la distension du duodénum, ​​à la distension du jéjunum et à l'eau laryngée.

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Réimpressions et autorisations

Ran, C., Boettcher, JC, Kaye, JA et al. Une carte du tronc cérébral pour les sensations viscérales. Nature 609, 320–326 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05139-5

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Reçu : 25 avril 2021

Accepté : 25 juillet 2022

Publié: 31 août 2022

Date d'émission : 08 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-05139-5

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